DETERMINACIÓN DE HELICOBACTER SPP EN CERDOS DE RIO CUARTO, ARGENTINA

DETERMINACIÓN DE HELICOBACTER SPP EN CERDOS DE RIO CUARTO, ARGENTINA

Autores: Mac Loughin, Virginia Hebe; Navarro, Osvaldo Esteban; Martinez, Ramiro Andrés; Grosso, María Carolina; Savino, Francisco, Ritta, Leandro, Van Deer Veen, María Paula; Gimenez, Sabrina Ramona; Merkis, Ceciclia Inés.

Resumen

El Helicobacter spp, es un microorganismo Gram negativo que se aloja en la mucosa gástrica y es considerado la principal causa de úlcera péptica. Estudios realizados confirman la implicancia del Helicobacter spp en patologías gástricas del hombre y otras especies animales, una de ellas el cerdo. Estas bacterias podrían ser patógenos responsables de zoonosis.

Los porcinos desarrollan de manera natural y frecuente úlceras gastroesofágicas (UGE), se han observado úlceras colonizadas por Helicobacter spp. Investigaciones realizadas en Colombia establecieron una prevalencia de ulceras gástricas porcinas de 34.8% en animales sacrificados en matadero relacionado a Helicobacter spp en la producción de lesiones gástricas. Sin embargo hay escasos reportes de Helicobacter spp en mucosa gástrica de cerdos en Argentina.

En el presente trabajo se determinó la presencia de Helicobacter spp en muestras gástricas de cerdos mestizos con diagnóstico de gastritis obtenidas de Frigoríficos de la zona de Río Cuarto. Para ello se evaluaron microscópicamente 54 muestras que fueron fijados en formol bufferado, incluidas en parafina y procesadas con la técnica histológica convencional para diagnóstico de gastritis.

Para la determinación del Helicobacter se utilizó Giemmsa, Inmunohistoquímica y Warthin Starry. La técnica inmunohistoquimica se realizó con Ac comerciales. La tinción con hematoxilina/eosina permitió diagnosticar diferentes tipos de gastritis en las muestras de cerdos, en las que pudimos observar mayor proporción de lesiones crónicas que agudas.
Las tinciones de Giemsa y Warthin-Starry permitieron poner de manif iesto dos especies del género Helicobacter en las muestras gástricas. En este estudio los resultados nos indican que el 48% de las muestras fueron Helicobacter (+), el 35% presentaron gastritis Helicobacter (-) y el 17% restante fueron mucosas normales. Este hallazgo permitirá aportar conocimientos básicos para futuros estudios del rol que cumple el Helicobacter en la especie en estudio.

Introducción

El Helicobacter spp, es un microorganismo Gram negativo que se aloja en la mucosa gástrica y es considerado la principal causa de úlcera péptica (1.2.3). Fue observado por primera vez por el patólogo Robin Warren a principios de junio de 1979. Su detección en estudios histopatológicos continuó por un par de años asociando la presencia del microorganismo con enfermedades gástricas en el hombre. Durante este tiempo, hubo muchos intentos de aislar  la bacteria pero sin ningún éxito (4.5.6.7.8).

En 1981, el médico gastroenterólogo Barry Marshall se une a la investigación realizada por Warren y confirma los resultados de este último. Sin embargo fue hasta 1982 que el Helicobacter pylori pudo aislarse por primera vez. En 1984, se publicó en la revista Lancet la asociación del Helicobacter pylori con la gastritis crónica y por primera vez se sugirió que la úlcera péptica pudiera ser de etiología infecciosa. Recién en 1985 Marshall demostró la capacidad de la bacteria de causar enfermedad (9.10.1).

En el año 2005, los doctores Warren y Marshall fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por el descubrimiento del Helicobacter pylori y su papel en el diagnóstico, prevención y tratamiento de gastritis crónicas, úlceras gastroduodenales, linfoma gástrico y en cierta forma del cáncer gástrico por parte de este microorganismo (11.7).Estudios realizados confirman la implicancia del Helicobacter spp en patologías gástricas del hombre y otras especies animales, una de ellas el cerdo (12.13). No se sabe exactamente como  Helicobacter se transmiten de animales a humanos, pero lo más probable es que se produzca a través del contacto directo. Vivir en proximidad con gatos, perros y en especial con cerdos, se constituye en un factor de riesgo para estas infecciones. La intensidad del contacto con animales también es importante ya que se observó una mayor incidencia de estas afecciones en criadores de cerdos y personal de mataderos (Haesebrouck et al., 2009; Liang et al., 2013).

En las afecciones gástricas humanas, H. pylori es el microorganismo más frecuentemente hallado aunque también en esta especie se ha reportado la presencia de H. suis (Haesebrouck et al., 2009).Es por ello que estas bacterias podrían ser patógenos responsables de zoonosis (14). Los porcinos desarrollan de manera natural y frecuente úlceras gastroesofágicas (UGE); se han observado úlceras colonizadas por Helicobacter spp. Investigaciones realizadas en Colombia establecieron una prevalencia de ulceras gástricas porcinas de 34,8% en animales sacrificados en matadero, relacionando a Helicobacter spp con la producción de lesiones gástricas (15.16). Por otro lado, diversos estudios han establecido que el H. suis, asociado a úlceras estomacales en cerdos, pueden ser causal de muerte súbita provocando de esta manera un impacto desfavorable sobre la producción. En Argentina existen escasas publicaciones de Helicobacter spp en mucosa gástrica de cerdos. Debido a la importancia zoonótica de Helicobacter spp y a la falta de antecedentes sobre la presencia de ésta y otras especies de la bacteria en nuestro país, el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de Helicobacter spp en muestras gástricas de cerdos provenientes de criaderos de la zona sur de la provincia de Córdoba (Argentina).

Por ello, se estima que el presente estudio aportaría conocimientos no solo a las ciencias básicas, sino también a aquellas relacionadas con la Producción Animal y la Salud Pública, debido al  vínculo disciplinar e interdisciplinar que se establece respectivamente y al convocar aspectos comunes relacionados con patologías que afectan a la especie humana y animal.

Materiales y métodos

Este trabajo cuenta con el aval del comité de ética de la UNRC.

Se tomaron muestras de estómagos de cerdos mestizos de diferentes edades y sexos provenientes de frigoríficos de la zona de Río Cuarto, Argentina, considerados libres de enfermedad, de acuerdo al examen clínico y postmortem realizado.  Se procesaron 54 biopsias gástricas tomadas principalmente de la región antral, que fueron lavadas con solución salina de Hank’s (SSH) (Gibco) y luego inmediatamente fijadas con formol salino tamponado. Una vez fijadas fueron sometidas a la técnica histológica convencional; se deshidrataron con baterías de alcoholes de graduación creciente, y se incluyeron en parafina. Se realizaron cortes histológicos de aproximadamente 4 µm. Parte de los cortes fueron teñidos con hematoxilina-eosina para el diagnóstico de gastritis, y con Giemsa y Warthin Starry para la detección de Helicobacter spp. El resto de los cortes fueron sometidos a estudios inmunohistoquímicos para la detección de Helicobacter spp utilizando anticuerpos comerciales (anti-Helicobacter pilory 215 A 76 Cell Marque Corporation, USA Santa Cruz Biotechnology Inc, USA, (17).

Una vez realizado el diagnóstico histopatológico se procedió a dividir las biopsias gástricas en diferentes grupos

Grupo A: cerdos G/H+: Cerdos con gastritis agudas con presencia de Helicobacter spp.

Grupo B: cerdos G/H- : Cerdos con gastritis agudas sin presencia de Helicobacter spp.

Grupo E: cerdos G/H+: Cerdos con gastritis crónicas con presencia de Helicobacter spp.

Grupo C: cerdos G/H- : Cerdos con gastritis crónicas sin presencia de Helicobacter spp.

Grupo D: Cerdos con mucosas gástricas normales

La adquisición de las imágenes se realizó mediante una cámara digital Powershot G6, 7.1 Megapixeles (Canon Inc, Japón) adosada al microscopio óptico.

Para el estudio morfométrico de Helicobacter spp se utilizó la tinción de Warthin Starry;  las variables analizadas fueron longitud y ancho de los microrganismos. Las imágenes se procesaron a través del software AxioVision Axio Vs40 V 4.6.3.0 (Carl Zeiss, Alemania). Se contaron 100 microorganismos por muestra en un aumento de 1000 x.

 Resultados

En la evaluación histopatológica de la mucosa gástrica de muestras diagnosticadas con gastritis aguda, se observó infiltrado leucocitario abundante en la lámina propia (Figura 1).

En la Figura 2 se muestra una biopsia gástrica teñida con Giemsa con diagnóstico de gastritis aguda, donde se observa la presencia de bacterias con forma bacilar correspondientes a Helicobacter spp.

Con la tinción de Warthin Starryn en una muestra gástrica de la región antral de cerdos, con diagnóstico de gastritis aguda H (+) se observa la presencia de Helicobacter spp (Figura 3)

La Figura 4 observamos la inmunomarcación de Helicobacter spp con anticuerpo anti-H pylori.

A través del software AxioVision Axio Vs40 V 4.6.3.0 (Carl Zeiss, Alemania) se realizaron diferentes determinaciones morfométricas en los Helicobacter encontrados en las muestras gástricas de cerdos (Figura 5). Las variables analizadas fueron longitud y ancho de los microorganismos. Los microorganismos encontrados presentaron entre 1 μm a 6 μm de longitud y entre 0,4 μm a 1 μm de ancho De acuerdo a este criterio morfológico el 52,6 % de los microrganismos presentaban características compatibles con Helicobacter pylori; el 47,40% restante, características compatibles con Helicobacter heilmannii.

De las 54 muestras observadas se observó el 17% muestras pertenecían a muestras mucosa gástrica normal, 5% fueron diagnosticadas con gastritis agudas sin presencia de Helicobacter (-), 9 % muestras gastritis agudas Helicobacter (+), 30 % muestras presentaban gastritis crónicas Helicobacter (-) y 39% gastritis crónicas Helicobacter (+).

Discusión

Los resultados histopatológicos en muestras gástricas de cerdos permitieron detectar un infiltrado leucocitario y lesiones compatibles con gastritis agudas y crónicas, en coincidencia con lo publicado por otros investigadores (15.16).

Con respecto a la presencia de úlceras gástricas, el patrón morfológico y los cambios inflamatorios  hallados en cerdos son similares a los observados en humanos, excepto por su localización, debido a que en cerdos predominan en la pars oesophagea del estómago, mientras que en humanos aparecen en el bulbo duodenal y la mucosa prepilórica (19.15). La diferencia en la localización de las úlceras entre las dos especies podría explicarse por la presencia de un epitelio no secretor en la pars oesophagea del estómago del cerdo, que explicaría la ausencia de secreción de moco que actúe como un mecanismo de tampón para neutralizar la acidez gástrica. Las lesiones histopatológicas encontradas en los estómagos de cerdo en nuestro estudio concuerdan con las investigaciones de Rodriguez y col., 2008 y en 2009, quienes encontraron una mayor proporción de las mismas en lesiones crónicas.

Para la determinación de Helicobacter spp en las muestras gástricas de cerdos, la técnica histológica utilizada reveló la presencia de bacterias espiraladas que concuerdan con las descripciones previas de Helicobacter spp. Sin embargo, la coloración con  Giemsa permitió el reconocimiento específico del agente patógeno (20.21). En concordancia con Rodriguez y col., 2008 el Helicobacter se detectó en el epitelio, a nivel de  las fosetas y  glándulas gástricas.

Este hallazgo confirma lo publicado  por otros investigadores que observaron la presencia del Helicobacter spp en el estómago de cerdos, con mayor frecuencia en la mucosa fúndica y pilórica, asociando  la gastritis pilórica con la infección por esta bacteria (12.15.16).

La evaluación histológica con la coloración de Warthin-Starry en las especies estudiadas permitió observar microorganismos con las características morfológicas de Helicobacter spp. Con esta tinción, pudimos observar al menos dos tipos de Helicobacter spp: uno de ellos de mayor tamaño e intensamente espiralado, y el otro de tamaño menor y con forma de “S”, como la  descripta para H. heilmannii y H. pylori.  Teniendo en cuenta que algunos investigadores sugieren que H. heilmannii, H. pylor y H. suis pueden colonizar de manera natural el estómago de cerdo, y que un mismo género bacteriano podría asumir patrones morfológicos diferentes por causas inherentes al ambiente gástrico particular del huésped, se necesitarán  nuevos estudios para tipificar las especies propias de los cerdos y para identificar con precisión los tipos morfológicos encontrados en el presente trabajo (19.16.22).

A partir del análisis morfométrico de los  microrganismos podemos inferir que existe más de una especie de Helicobacter en el estómago de los cerdos, que podrían corresponder con H pylori y H heilmannii (15.16).

Investigadores dan cuenta que debido a que entre el 13,9% y el 78,5% de infecciones humanas con Helicobacter no-pylori son producidas por H. suis y que la transmisión al ser humano podría ocurrir por el consumo de carne porcina es que estamos profundizando nuestras líneas de investigación.

Conclusión

A través de la técnica histológica convencional hematoxilina/eosina se logró el diagnóstico de los diferentes tipos de gastritis en las muestras gástricas de cerdo, pudimos observar mayor proporción de lesiones crónicas que agudas.

Las tinciones diferenciales de Giemsa y Warthin-Starry en las muestras gástricas permitieron determinar la presencia de Helicobacter spp. Con la tinción de Warthin-Starry, pudimos visualizar dos especies del género Helicobacter.

En la especie estudiada  la inmunodetección de Helicobacter spp. se expresó en el epitelio, foseta gástrica y glándula gástrica. Sin embargo, la mayor colonización por Helicobacter fue detectada en la región antral.

La presencia de Helicobacter spp en estómagos de cerdo indica la capacidad del microrganismo para infectar de manera natural a esta especie animal. En las muestras estudiadas encontramos más de una especie de Helicobacter.

Figura 1- Microscopía óptica de muestra gástrica, región antral con diagnóstico de gastritis. LP: lámina propia. G: glándula gástrica. IL: infiltrado leucocitario. Tinción H/E (400 x).

Figura 2- Microscopía óptica de muestra gástrica, región antral con diagnóstico de gastritis H (+). Helicobacter spp. (flecha). Tinción de Giemsa (1000 x).

Figura 3- Microfotografía de muestra gástrica región antral con tinción de Warthin-Starry donde se observan Helicobacter spp (flecha), (1000x).

Figura 4- Microfotografías de muestras gástricas de cerdos de la región antral. Inmunomarcación de Helicobacter spp (flecha). 1000x.

Figura 5-Microfotografía de muestra gástrica región antral con tinción de Warthin-Starry donde se observan Helicobacter spp, con forma “s” itálica (rojo), y con forma espiralada y tamaño mayor (azul) (1000x).

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